Giriş
Farklılaşmış hücrelerin yeniden programlanması ile elde edilebilen uyarılmış pluripotent kök hücreler (uPKHler), kendilerini yenileyebilme ve vücuttaki herhangi bir hücreye farklılaşabilme potansiyelleri dolayısıyla otolog hücre tedavisi, hastalık modellemesi, ilaç tarama gibi birçok alanda yüksek kullanım potansiyeline sahiptir. uPKH eldesinde farklı yöntemler kullanılmaktadır. Yapılarında bakteriyel dizi bulundurmayan, yeniden programlama faktörlerini (Oct4, Klf4, Sox2, c-Myc) ve p53’e karşı kısa hairpin RNA kodlayan ve genoma entegre olmayan kodon-optimize mini intronik plazmidler (4-in-1 CoMiPler), uPKH eldesi için uygun vektörlerdir. Bu amaç doğrultusunda, CoMiPlerin hedef hücrelere aktarılabilmeleri (transfekte edilebilmeleri) ve taşıdıkları gen dizilerinin ekspresyonunu yeterli oranda ve yeterli süre boyunca gerçekleştirebilmeleri gerekir. Transfeksiyona dirençli hücrelerde ise optimum tranfeksiyon şartları belirlenerek direnç kırılmalıdır. Çalışmamızda, CoMiPlerin transfeksiyona dirençli olarak bilinen BJ insan fibroblastlarında uPKH eldesinde kullanılabilmesi için etkin transfeksiyon ve ekspresyonun sağlanmasını hedefledik.
Materyal-Metod
BJ fibroblastlar ve kontrol olarak 293T hücreleri, 24 kuyucuklu hücre kültür kaplarında kültüre edildikten sonra, CoMiPler veya kırmızı floresan protein (RFP) kodlayan kontrol plazmidlerle transfekte edildi. İkinci bir metod olarak, farklı volt ve atımlarda yapılan denemelerle (160V, 250V, 500V, 1650V, tek/çift atım) elektroporasyon yöntemi uygulandı. Transfeksiyon etkinliklerinin değerlendirilmesi, transgen ışımalarının 18. saatten başlayarak belirli aralıklarla izlenmesi ile gerçekleştirildi. Hücre sağkalım oranları takip edildi.
Bulgular
CoMiPlerin uPKH eldesi amacıyla BJ hücrelerine aktarımında lipofektamin aracılı transfeksiyonun uygulanan şartlarda etkin olmadığı; elektroporasyonun ise hem 293T hem de BJ hücrelerinde etkin tranfeksiyon sağladığı gözlendi. BJ hücreleri için sağkalımı da koruyan en iyi sonuç, 250V/tek atımda elde edildi. CoMiPlerde taşınan tdT floresan belirteç gen ışımasının pozitifliği, plazmidin taşıdığı yeniden programlama faktörlerinin hücrelerde ifade edilebildiğini gösterdi. Yirmi günlük takip süresince hücrelerde sağkalım ve ekspresyon oranlarının korunduğu gözlendi.
Sonuç
BJ insan fibroblast hücrelerinden CoMiP aracılı uPKH eldesi için, hücrelerdeki direnç 250V/tek atımda uygulanan elektroporasyon ile aşılabilir ve etkin transfeksiyon ve ekspresyon sağlanabilir. Çalışmamızın nihai amacı, uPKHlerin yüksek verimlilikle elde edilmesi ve pankreatik beta hücrelerine farklılaştırılmasıdır (TÜBİTAK Proje No: 218S617).
İletişim Bilgileri
Şeymanur Yazgan
E-Mail: This email address is being protected from spambots. You need JavaScript enabled to view it.